Тезисы XVI Всероссийской конференции по ветеринарной анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии

22-23 апреля 2021 г. Москва, отель «Милан»

 

Исследование гемостаза: от стеклянной палочки до глобальных методов

 

Наталья Валентиновна Пашинцева к.б.н.
Ветеринарная клиника «Биоконтроль», г.  Москва

 

Гемостаз – это сложный процесс, включающий в себя регулируемые по времени и пространству взаимодействия между стенкой кровеносного сосуда и циркулирующими тромбоцитами, лейкоцитами, эритроцитами, тканевым фактором (TF, Фактор свёртывания крови III, тромбопластин), а также прокоагулянтными, антикоагулянтными и фибринолитическими белками плазмы. В здоровых сосудах, покрытых неповрежденным эндотелием, преобладают антикоагулянтные реакции, которые поддерживают кровь в жидком состоянии. К ним относятся синтез простациклина и оксида азота – ингибирование тромбоцитов и расширение сосудов, наличие на эндотелии тромбомодулина – ингибирование тромбина, наличие веществ, ингибирующих агрегацию тромбоцитов и др.

Повреждение кровеносных сосудов приводит к активации тромбоцитов и прокоагулянтных свойств сосудистой стенки.  В частности, выход в кровоток тканевого фактора, синтез, аккумуляция и высвобождение фактора фон Виллебранда, а также появление ингибиторов фибринолиза.

Различают первичный и вторичный гемостаз. Первичный гемостаз происходит в сосудах мелкого калибра и обеспечивается, в основном, тромбоцитами при немаловажном участии фактора фон Виллебранда. Тромбоциты играют доминирующую роль в этом процессе. В месте повреждения они быстро связываются, меняют форму, распространяются и прочно закрепляются на открытых субэндотелиальных белках. Известно, что основной патологией первичного гемостаза является тромбоцитопения, реже диагностируются нарушение функции тромбоцитов и болезнь фон Виллебранда. Клинические признаки связаны с появлением мелких кровоизлияний, таких как эпистаксис, гематурия, гематомезис, гематохезия, кровоизлияниями на коже (петехии, экхимозы). Обычно объемных кровоизлияний не наблюдается, так как мелкие сосуды непрочно, но закупориваются нитями фибрина.

В сосудах более крупного калибра функций тромбоцитов образовывать тромбоцитарную пробку недостаточно, так как ее диаметр не превышает объем поражения и кровь начинает устремляться из сосуда в окружающие ткани. Для остановки таких кровотечений необходима активация коагуляционного каскада с участием множества факторов свертывания (вторичный гемостаз). Результатом коагуляции является формирование плотного фибринового сгустка, в который интегрируются форменные элементы крови (тромбоциты, лейкоциты, эритроциты). В частности, нарушение вторичного гемостаза проявляется обильными кровоизлияниями в полости тела, суставы.

Исследование гемостаза включает в себя клиническую оценку животного, проведение общих лабораторных анализов (общий клинический анализ крови, биохимический), а также специфических тестов, оценивающих гемостаз.

При подозрении на патологии первичного гемостаза, в первую очередь, проводится общий клинический анализ крови с оценкой количества тромбоцитов и/или тромбокрита. Обязательным также является микроскопия мазка и дифференцировка истинной и ложной тромбоцитопении (рисунок 1).

 

Рисунок 1. Слева образец крови с истинной тромбоцитопенией, справа – агрегация тромбоцитов (ложная тромбоцитопения).

 

Если клинические признаки нарушения первичного гемостаза наблюдаются при нормальном количестве тромбоцитов, то проводятся дополнительные тесты: исследование функции тромбоцитов, оценка времени остановки букального кровотечения (рисунок 2), анализы на болезнь фон Виллебранда и др.

 

Рисунок 2. Набор для определения времени кровотечения Surgicutt Bleeding Time Devic. Тест не проводится при наличии тромбоцитопении, является субъективным (зависит от наблюдателя, тугости повязки, глубины разреза, техники промакивания).

 

Для оценки вторичного гемостаза традиционного используют коагулограмму. Данный тест в рутинной практике выполняется на коагулометрах (рисунок 3)

 

А	Б

Рисунок 3. Коагулометры для оценки активности факторов свертывания. Оптический (А), портативный (Б).

 

Коагулограмма оценивает активность факторов внешнего и внутреннего пути коагуляции и определяет только их недостаток, поэтому подходит только для диагностики гипокоагуляционных состояний. В частности, измерение протромбинового времени (PT) запускается добавлением реагента TF и ​​кальция к исследуемому образцу. Пациенты с дефицитом  фактора внешнего или факторов общего пути (например, факторы I, II, V и X) демонстрируют увеличенное время свертывания PT. Активированное частичное время свертывания (АЧТВ), чувствительно к недостаточности факторов внутреннего пути коагуляции (факторы VIII, IX, XI и XII), а также общего пути, перечисленных выше. Стоит отметить, что данный метод позволяет диагностировать гипокоагуляцию только при значительном снижении активности факторов (<30% активности от нормы).

В ветеринарной практике, также как и в медицине человека, имеются патологии гемостаза, связанные с избыточной активацией различных звеньев гемостаза, а также повреждением сосудистой стенки, что сопровождается гиперкоагуляционными состояниями, например, образованием тромбов или развитием синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС). Все перечисленные выше тесты не предназначены для диагностики этих патологий и позволяют выявить только косвенные изменения (например, тромбоцитопению при повышенном потреблении тромбоцитов на образование тромба или снижение активности факторов свертывания).

Исследование Д-димера нередко применяется в ветеринарной практике. Его концентрация указывает на количество разрушенных кровяных сгустков в организме, поэтому он является маркером фибринолиза (стадией лизиса фибринового сгустка). Действительно, повышенный фибринолиз обычно указывает на ранее предшествующее повышенное свертывание крови в организме, что может быть характерным для ДВС-синдрома и других тромбоэмболических заболеваний. Однако Д-димер имеет ограниченное значение при диагностике тромбозов, так как его повышение наблюдается не только при состояниях гиперкоагуляции (ДВС, тромбоэмболический синдром), но и при кровотечениях. В частности, кровоизлияние (например, травма) в организме приводит к образованию фибриновых сгустков, которые расщепляются на FDP и D-димер, следовательно, повышенная концентрация D-димера не специфична для ДВС-синдрома. D-димер менее 0,25 мкг/мл имеет высокую отрицательную прогностическую ценность и его низкий уровень исключает тромбозы в 95% случаев, но его высокий уровень абсолютно не специфичен для диагностики тромбоза и ДВС.

Глобальные методы гемостаза оценивают все элементы свертывания крови, за исключением состояния сосудистой стенки. Они позволяют диагностировать как гипокоагуляции, так и гиперкоагуляцию. Кроме того, в медицине человека их широко используют для оценки эффективности антикоагулянтной терапии.

Среди широко используемых в медицине человека методов глобального гемостаза известны тромбэластография (ТЭГ) и ротационная тромбэластометрия (ТЭМ) (Рисунок 4).

 

А	Б

Рисунок 4. Прибор TEG 5000 для выполнения тромбоэластографии (А), прибор Rotem® для выполнения тромбоэластометрии.

 

В ветеринарной медицине данные методы также находят свое применение. В частности, их возможно использовать для оценки гиперкоагуляционного статуса у собак, находящихся на длительной терапии кортикостероидами или при эндогенном гиперадренокортицизме. Методом тромбоэластографии возможно проведение оценки гемостаза у пациентов с диссеменированным внутрисосудистым свертыванием. Так, Wiinberg В. с коллегами показали, что уровень смертности составляет 64% у собак с гипокоагуляцинным статусом, 59% с при нормокоагуляции, и ниже при выявлении гиперкоагуляции, составляя 32%.  При открытой фазе ДВС 82% собак имели гипокоагуляцию, нормокоагуляционный статус диагностировался у 22% и, только у 5% пациентов отмечалась гиперкоагуляция по ТЭГ.

К сожалению, данный метод глобального исследования гемостаза пока не получил широкого применения в ветеринарной медицине в России. В частности, это связано с ограниченной доступностью и высокой ценой необходимого оборудования, особенностями проведения исследования и отсутствием референсных интервалов.

Относительно новым методом исследования гемостаза, который наряду с ТЭГ и ТЭМ относится к глобальным, является тромбодинамика.

Тромбодинамика – первый клинический лабораторный тест, учитывающий пространственную организацию процесса роста фибринового сгустка. Этот метод разработан в начале 2000-х годов командой российских ученых во главе с членом-корреспондентом РАН, доктором биологических наук, профессором Фазоилом Иноятовитчем Атауллахановым.

В основе метода тромбодинамики лежит принцип разделения в пространстве процесса активации и роста фибринового сгустка. Активация свертывания запускается от поверхности с иммобилизованным рекомбинантным ТФ, которая имитирует место повреждения стенки кровеносного сосуда. Далее сгусток распространяется в плазме уже без контакта с активирующей поверхностью (рисунок 5).

Тест тромбодинамики проводится с помощью лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2» (рисунок 6). Предварительно подготовленные образцы плазмы крови помещают в два канала измерительной кюветы. Затем в кювету вводят специальную вставку-активатор, на торцы которой нанесено покрытие, содержащее липиды и тканевой фактор. В момент соприкосновения плазмы крови с вставкой-активатором запускается процесс свертывания, и от торца вставки-активатора начинается

рост фибринового сгустка.

 

Рисунок 5. Принцип метода тромбодинамики.

 

Этот процесс регистрируется прибором в режиме последовательной фотосъемки цифровой фотокамерой при помощи метода темного поля (регистрация картины светорассеяния) в течение 30 мин. Полученная серия фотоизображений показывает, как размеры, форма и структура фибринового сгустка меняются во времени.

Метод тромбодинамики позволяет диагностировать различные нарушения гемостаза. При помощи визуальной оценки и установленных цифровых параметров (задержку роста сгустка – Tlag, скорость роста сгустка – V, начальную скорость роста сгустка –Vi, стационарную скорость роста сгустка – Vst, размер сгустка через 30 мин – CS, плотность сгустка – D) существует возможность диагностики как гипокоауляционных, так и гиперкоагуляционных состояний.

В медицине человека данный метод широко используют для диагностики нарушения гемостаза у пациентов из групп высокого риска развития венозных тромбоэмболических осложнений – состояние после эндопротезирования суставов, у пациентов, перенесших тромбоз глубоких вен (ТГВ) нижних конечностей, при множественной миеломе, у беременных женщин, женщин в раннем послеродовом периоде после операции кесарева сечения и др. Кроме того, данный тест рекомендован при контроле эффективности терапии гепаринами, варфарином, новыми оральными антикоагулянтами и назначении минимально эффективной дозы.

Клинические исследования демонстрируют, что тест тромбодинамики более чувствителен к терапии гепаринами, чем АЧТВ, тест генерации тромбина и тромбоэластография. Кроме того, в других тестах гемостаза, в отличие от тромбодинамики, не выявлена связь показателей с возрастанием D-димеров.

В ветеринарии данный метод пока еще нуждается апробации и определения референсных значений. Соответствующие научные публикации в доступных европейских и американских журналах отсутствуют. Однако, как и в медицине человека, предполагается высокая значимость в диагностике врожденных и приобретенных нарушений гемостаза у мелких домашних животных при помощи тромбодинамики.

С целью внедрения метода тромбодинамики в ветеринарии, в ветеринарном онкологическом научном центре «Биоконтроль» уже начаты исследования гемостаза у здоровых собак и кошек.

 

Цитированные источники:

1. Rose et al. Effect of canine hyperadrenocorticism on coagulation parameters. J Vet Intern Med, 2013; 27(1):207-11.
2. Rose et al. Effect of prednisone administration on coagulation variables in healthy Beagle dogs. Vet Clin Pathol. 2011, 40(4):426-434.
3. Brooks et al. Current diagnostic trends in coagulation disorders among dogs and cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2013, 43(6):1349-72.
4. Wiinberg et al. Thromboelastographic evaluation of hemostatic function in dogs with disseminated intravascular coagulation. Vet Intern Med, 2008;22(2):357-65.
5. Balandina A.N. et al. Thrombodynamics: a new method to the diagnosis of hemostasis system disorders. Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology. 2018; 17 (4): 114‒